Как определить концентрацию ДНК ?

С помощью электрофореза в агарозном геле, концентрацию нуклеиновой кислоты в образце можно оценить только приблизительно, сравнив интенсивность полосы нуклеиновой кислоты с соответствующей полосой размерного маркера. Если добавить 2 мкл образца неразбавленной ДНК в гель, и полоса будет иметь примерно ту же интенсивность, что и полоса из 100 нг стандарта той же длины, образец будет иметь концентрацию, приблизительно, 50 нг/мкл (100 нг поделенных на 2 мкл).

Помимо приблизительной оценки концентрации образцов, электрофорез в агарозном геле помогает проверить их чистоту после протоколов экстракции нуклеиновых кислот. Если, например, была извлечена геномная ДНК, далее возможно провести гель-электрофорез, чтобы увидеть, загрязнены ли образцы РНК, которая может быть обнаружена как низкомолекулярный мазок.

Наиболее распространенным методом определения выхода и чистоты ДНК является измерение поглощения ультрафиолета самой нуклеиновой кислотой. Спектрофотомерия проста и требует общедоступного лабораторного оборудования. Все, что необходимо для метода измерения поглощения — это спектрофотометр, оснащенный УФ-лампой, УФ-прозрачные кюветы (в зависимости от прибора) и раствор очищенной ДНК. Показания абсорбции измеряются при λ = 260 нм (A₂₆₀), где ДНК поглощает свет наиболее сильно, а полученное число позволяет оценить концентрацию раствора. Показание A₂₆₀ должно находиться в пределах линейного диапазона прибора (обычно 0,1–1,0).

Концентрация ДНК оценивается путем измерения поглощения при 260 нм с корректировкой измерения A₂₆₀ для показания мутности раствора (измеряется по поглощению при λ = 320 нм) [5]. Далее разница измерений умножается на коэффициент разведения (для кюветных спектрофотометров). Показание спектрофотометра A₂₆₀ = 1 эквивалентно приблизительно 50 мкг/мл - для чистой двуцепочечной ДНК, 40 мкг/мл для РНК и 33 мкг/мл для одноцепочечной ДНК [4].

Концентрация ДНК (мкг/мл) = (показание A₂₆₀ – показание A₃₂₀) × коэффициент разведения × 50 мкг/мл

Общий выход получают путем умножения концентрации ДНК на конечный общий объем очищенного образца.

Выход ДНК (мкг) = концентрация ДНК × общий объем образца (мл)

Однако, ДНК — не единственная молекула, способная поглощать ультрафиолетовый свет с длиной волны 260 нм. Поскольку РНК также обладает большим поглощением при 260 нм, а ароматические аминокислоты, присутствующие в белке, поглощают свет при 280 нм, для раствора ДНК оба являются контаминантами и, если они присутствуют в растворе ДНК, будут способствовать общему измерению при 260 нм. В таком случае показатели будут завышены.

Чтобы оценить чистоту ДНК, необходимо измерить оптическую плотность в диапазоне от 230 нм до 320 нм, для обнаружения других возможных загрязнений.

Наиболее распространенным расчетом чистоты является отношение оптической плотности при 260 нм, к измерению при 280 нм. ДНК хорошего качества будет иметь соотношение A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,7 – 2,0 (1,8), чистая РНК ~ 2,1. Показания, выходящие из данного диапазона, например 1,6, не делают ДНК непригодной для любых приложений, но более низкие соотношения указывают на присутствие большего количества загрязняющих веществ. Соотношение можно рассчитать с поправкой на мутность (поглощение при 320 нм).

Чистота ДНК (A₂₆₀/A₂₈₀) = (показание A₂₆₀ – показание A₃₂₀) ÷ (показание A₂₈₀ – показание A₃₂₀)

Сильное поглощение при λ = 230 нм может указывать на присутствие органических соединений (фенола) или хаотропных солей в очищенной ДНК. Соотношение 260 нм / 230 нм может помочь оценить уровень солей в растворе. Чем ниже соотношение A₂₆₀/A₂₃₀, тем большее количество тиоцианатной соли присутствует в растворе с ДНК. Отношение А₂₆₀ /А₂₃₀ обычно составляет от 2,3 до 2,4 для двухцепочечной ДНК и от 2,1 до 2,3 для РНК [1].

Показание при 320 нм на наличие помутнения в растворе – также является признаком возможного загрязнения.

Таким образом, при оценке чистоты ДНК, наиболее информативным является спектр показаний от 230 до 320 нм [3].

Пример расчета концентрации и чистоты ДНК:

Расчет концентрации ДНК:
Концентрация ДНК (мкг/мл) = (показание A₂₆₀ – показание A₃₂₀) × коэффициент разведения × 50 мкг/мл
1. A₂₆₀ = 0,127
2. A₃₂₀ = 0,004
3. Концентрация дцДНК (мкг/мл) для 1 единицы A₂₆₀ = 50 
4. Коэффициент разведения = 100 (5 мкл ДНК + 495 мкл буфера)
Концентрация ДНК (мкг/мл) = (0,127 – 0,004) х 100 х 50 = 615 или 615 нг/мкл.

Расчет чистоты ДНК A₂₆₀/A₂₈₀:
Чистота ДНК (A₂₆₀/A₂₈₀) = (показание A₂₆₀ – показание A₃₂₀) ÷ (показание A₂₈₀ – показание A₃₂₀)
1. A₂₆₀ = 0,127
2. A₂₈₀ = 0,068
3. A₃₂₀ = 0,004
Чистота ДНК (A₂₆₀/A₂₈₀) = (0,127 – 0,004) ÷ (0,068 – 0,004) = 1,92. 

Вывод: Значение входит в диапазон 1,7 – 2, но близко к верхнему пороговому значению, из чего следует вывод, что получен препарат ДНК хорошей чистоты, но с потенциальной примесью РНК. Поэтому необходимо провести дополнительный анализ на наличие РНК, например, гель-электрофорез.

В отличие от спектрофотометрии, флуориметрия требует дополнительных наборов красителей для осуществления измерения. Это означает, что для проведения измерения необходимо приобрести набор, подходящий для целевого образца, состоящий из флуоресцентного красителя, буфера и стандартов. При подготовке образцов необходимо следовать инструкциям производителя набора, чтобы убедиться, что флуоресцентный краситель связывается с целевыми нуклеиновыми кислотами и стандартами. Обратите внимание, что важно избегать попадания пузырьков воздуха на этапах пипетирования и смешивания, поскольку впоследствии они могут негативно повлиять на измерения флуориметра.

Перед началом измерений на флуориметре, необходимо откалибровать прибор, измерив пробирки со стандартами. Первый стандарт должен указывать концентрацию 0 нг/мл, а последний — максимальную концентрацию в диапазоне анализа. Измерения возможно проводить после калибровки флуориметра [8].

Наиболее распространенные флуоресцентные красители представлены в таблице ниже. 

Важно!

Флуориметр рассчитывает только концентрацию нуклеиновой кислоты.  Чистота нуклеиновых кислот не может быть рассчитана с помощью флуорометрии, поскольку она обнаруживает только флуорофоры, связанные с нуклеиновыми кислотами, и поэтому не может обнаружить загрязнители.

Итак, флуориметры не могут измерять чистоту образцов нуклеиновых кислот, а только их концентрацию. Еще одним недостатком по сравнению со спектрофотометрией является то, что флуориметрия более дорогая из-за дорогих наборов для анализа и требует больше времени, поскольку необходимо смешивать образцы с флуоресцентным красителем перед анализом.

Преимущества флуориметрии перед спектрофотометрией заключаются в том, что флуориметрия гораздо более чувствительна и дает лучшие результаты с разведенными образцами. Нижний предел обнаружения спектрофотометра NanoDrop^TM (Thermo Fisher Scientific) составляет 0,4 нг/мкл, тогда как нижний предел обнаружения флуориметра Qubit (Thermo Fisher Scientific) составляет 0,005 нг/мкл. [7,9]. Кроме того, флуориметры не завышают концентрацию нуклеиновых кислот, поскольку они не определяют поглощение других компонентов образца, например белков. Еще одним преимуществом флуориметрии является то, что имеется возможность использовать микропланшетные ридеры, способные анализировать весь микропланшет за одно измерение, что значительно увеличивает производительность.

После проведения ПЦР, ни чувствительность измерения, ни переоценка концентрации обычно не являются проблемой, поскольку в пробирке в любом случае присутствует очень большое количество интересующего сегмента нуклеиновой кислоты (ампликона). Это означает, что спектрофотометрия является предпочтительным методом определения концентрации ДНК после реакции ПЦР, только если не стоит задача очень точного определения концентрации, например, если последующим приложением является секвенирование следующего поколения (NGS). Для анализов NGS представляется возможным объединить до 96 образцов, чтобы проанализировать их за один раз, и эти образцы должны иметь одинаковую концентрацию для получения желаемых результатов, что делает флуориметрию идеальным методом.

Поскольку очень важно иметь одинаковую концентрацию нуклеиновой кислоты во всех образцах при объединении для анализа NGS, возможно перепроверить результаты флуориметрии, например, с помощью системы TapeStation (Agilent Technologies). Данная система работает аналогично гель-электрофорезу, но полностью автоматизирована. После того, как пользователь загружает образцы, наконечники и кассету ScreenTape (небольшую кассету, содержащую электроды, гелевую матрицу и буфер, подходящий для целевого образца), система может автоматически анализировать до 16 образцов, а также предоставит изображение геля и концентрацию измерения каждого образца [10].

Для проверки успешности различных протоколов выделения нуклеиновых кислот и реакций ПЦР, а также для определения чистоты и концентрации образцов нуклеиновых кислот, необходимо использовать комбинацию методов количественного определения ДНК и РНК. Гель-электрофорез и спектрофотометрия подходят для большинства образцов и приложений, но, если вы работаете с разбавленными образцами или нуждаетесь в высокоточных измерениях концентрации для последующих приложений, таких как NGS, также может потребоваться флуориметрия.