Современные методы выделения нуклеиновых кислот

Для проведения молекулярно-генетических и диагностических методов исследований, таких как ПЦР, секвенирование, анализ на микрочипах, гибридизация, рестрикционный анализ и др., необходима чистая нуклеиновая кислота, выделенная из клеток/ткани. 
Геномная ДНК находится в ядре клетки. Чтобы экстрагировать ДНК, необходимо разрушить клеточную мембрану/клеточную стенку, а также ядерную оболочку, но на деле это может оказаться непростой задачей. Для этого требуется набор различных химических веществ и растворов, а также физических методов. Кроме того, различные клеточные структуры могут создавать проблемы при выделении ДНК, например, растительная клетка имеет жесткую клеточную стенку, поэтому выделение ДНК из растительных клеток затруднено [15].

Для каждого типа ткани требуется различный подход к экстракции ДНК, что усложняет задачу для лаборантов, студентов-исследователей и ученых. Факторы, вызывающие проблемы при выделении ДНК:

• Дифференциальный клеточный состав
• Различные типы тканей
• Разница в геномном содержании
• Химические вещества, используемые в процессе
• Подготовка раствора
• Тип используемого оборудования для физического разрушения клетки

И многое другое…

Поэтому важно понимать концепцию, требования и процесс различных методов выделения ДНК.

Принцип выделения ДНК можно разделить на три разных этапа:

1. Лизис клеточной стенки/мембраны и ядерной мембраны

2. Стабилизация ДНК

3. Преципитация и промывка.

Чтобы изолировать ДНК, мы должны разрушить клеточную мембрану и ядерную мембрану, которая состоит из гликопротеинов и липидов. Температурное нагревание, детергенты и ферменты могут эффективно справиться с такой задачей.

Как только мы получим ДНК, мы должны удалить загрязняющие вещества, не ставя под угрозу ее стабильность. Такие химические вещества, как ЭДТА и NaCl, предотвращают повреждение ДНК ДНКазами и защищают ее, в то время как центрифугирование может эффективно отделить основные крупные клеточные остатки от ДНК.

Чистую нуклеиновую кислоту осаждают в видимой форме с помощью спирта. Для осаждения лучше всего подходит изопропанол. Промывка спиртом удаляет другие белковые остатки и дает чистую ДНК.

Таким образом, Этапы выделения ДНК можно разделить на следующие:

1. Лизис клеточной мембраны или клеточной стенки

2. Лизис ядерной оболочки

3. Удаление клеточных остатков (дебриса)

4. Стабилизация и защита ДНК от ДНКаз

5. Осаждение ДНК

6. Отмывка и элюция ДНК

Выделение ДНК напрямую зависит от состава клеточной стенки/клеточной мембраны различных организмов. 

Напомним строение клеточной стенки растений и бактерий, а также клеточной мембраны млекопитающих: 

Клеточная стенка — это дополнительная оболочка, которая располагается с внешней стороны цитоплазматической мембраны. Такая оболочка есть у клеток не всех организмов, а только у растений, грибов, бактерий, части простейших (одноклеточных эукариот). Ее нет у животных клеток и многих простейших. Строение и функции клеточной стенки взаимосвязанно формировались в процессе эволюции. При этом ее химическое строение (в большей степени) и функции (в меньшей) у разных групп организмов различаются. Так у растений основным компонентом оболочки является целлюлоза, у грибов — хитин, у бактерий — пептидогликан (муреин).

Клеточная стенка бактерий может разрушиться физическим нагреванием до 60–70°C. Такой образец может быть непосредственно использован в ПЦР или путем добавления дополнительного этапа нагревания. Например, прямой ТБ-ПЦР тест (определение M. tuberculosis), в котором мы добавляем образец прямо в ПЦР - работает. Однако, использование лизирующего буфера значительно увеличивает чистоту и выход ДНК.

Твердая, жесткая и богатая полисахаридами клеточная стенка является уникальным свойством растительной клетки. Обычные физические методы, такие как нагревание и измельчение, и химические методы, такие как использование буферов для лизиса, не позволяют изолировать ДНК. Более того, наличие вторичных метаболитов усложняет общую задачу. Использование жидкого азота, гомогенизация тканей и добавление химических веществ, таких как CTAB, PVP и SDS, позволяют эффективно изолировать ДНК из растительных клеток.

Клетки животных лишены клеточной стенки и имеют только гладкую мембрану. Основа строения клеточной мембраны —липидный бислой. Он состоит из полярной головки, ассоциированной с водой, и гидрофобных хвостов, обращенных вовнутрь. Также в мембране могут присутствовать гликолипиды – соединение липидов и углеводов, холестерол – липиды стирольной группы. Примерное соотношение компонентов клеточной мембраны таково: белки - 55%, фосфолипиды - 25%, холестерол - 13%, другие липиды - 4%, углеводы - 3%.

Ввиду различий в строении клеточных стенок растений, бактерий, клеток животных, а также структуры тканей и их различных физических состояний, необходимо использовать различные методы и подходы к разрушению биологических структур и выделению нуклеиновых кислот.

Методы выделения ДНК можно подразделить на Физические и Химические (Таблица 1). 

Одним из наиболее распространенных методов выделения нуклеиновых кислот является жидкостная экстракция (химический метод), где для выделения нуклеиновых кислот используют только растворы различного химического состава. Данный набор методов напрямую зависит от приготовления лизирующего буфера. Буфер для лизиса часто готовят в виде одного или двух растворов, поскольку в нем используется много химических веществ. Обычными химическими веществами для жидкостной экстракции ДНК являются: фенол, хлороформ, изоамиловый спирт, SDS, CTAB, Triton X-100, Tris, EDTA, MgCl2, NaCl, PVP, бета-меркаптоэтанол и другие детергенты.

Методы разделения на основе спин-колонок и магнитных шариков представляют собой экстракцию ДНК из твердой и жидкой фаз, в которой используются как жидкий буфер для лизиса, так и твердые фазы, такие как силикагель или магнитные шарики. Такие группы методик безопасны, быстры и просты в исполнении, однако они отличаются увеличенной стоимостью.

Рассмотрим более подробно основные методы выделения нуклеиновых кислот:

Метод экстракции ДНК фенолом и хлороформом обычно используется в приложениях молекулярной биологии и диагностики, и его возможностей достаточно для выделения высококачественной и высокопродуктивной ДНК из любого биологического образца, включая клетки млекопитающих, части растений, бактерии и плазмиды.  Другими названиями этого метода являются «экстракция ДНК фенолом», «фенол-хлороформ», «экстракция ДНК изоамиловым спиртом» или «метод выделения PCI». Среди всех различных методов выделения ДНК данный метод является наиболее популярным. В нем используются три органических растворителя: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт. 

Принцип метода:

Метод выделения фенол-хлороформом основан на принципе жидкостной экстракции биомолекул. Взглянем на пробирку с химическими составляющими данного метода выделения нуклеиновых кислот (Рисунок 4). 

Пробирка заполнена фенолом, хлороформом, изоамиловым спиртом и клеточной суспензией. Фенол менее полярен, а водная часть (содержащая хлороформ) полярна по своей природе. Также, обратим внимание, что фенол плотнее воды, поэтому он остается на дне пробирки. ДНК представляет собой полярную молекулу, имеющую отрицательный заряд. Принцип полярности биомолекул гласит, что полярные молекулы растворяются в полярном растворителе, а неполярные молекулы в неполярном растворителе.

Вода, присутствующая в растворе, растворяет ДНК, но не белок, а фенол растворить ДНК не может. Из-за более высокой плотности фенол остается внизу. Таким образом, геномная ДНК остается в верхней водорастворимой части, а клеточный дебрис остается внизу пробирки. Центрифугирование осаждает клеточный дебрис и белок в нижней фенольной фазе, в то время как нуклеиновую кислоту можно аккуратно собрать из верхней фазы. Важно отметить, что во время процесса происходит эмульгирование, то есть образуется пенообразная эмульсия, которую следует удалить при помощи изоамилового спирта.

Осаждение

Осаждение или преципитация ДНК является методом очистки/концентрирования нуклеиновых кислот из растворов с помощью этанола (также используется изопропанол). В присутствии моновалентных катионов (например Na+) этанол эффективно осаждает нуклеиновые кислоты – катионы соли взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК, таким образом нейтрализуется заряд нуклеиновой кислоты, этанол усиливает данное взаимодействие и ДНК выпадает в осадок, который в дальнейшем может быть отделен с помощью центрифугирования [13]. Вместо этанола также можно использовать изопропанол; эффективность осаждения изопропанола выше, поэтому для осаждения достаточно меньшего объема. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и на последнем этапе требуется больше времени для высыхания на воздухе [5,23].

Элюция

Наконец, осадок ДНК необходимо растворить. Элюцию ДНК проводят буферным раствором или дистиллированной водой. Для длительного хранения нуклеиновых кислот используется Буфер TE (также известный как буфер «Tris-EDTA»). Как следует из названия он состоит из двух реагентов Трис и ЭДТА. Трис берет на себя роль поддержания буферной способности, в то время как ЭДТА связывает и делает ионы металлов недоступными для следов ДНКаз (если таковые имеются) [21].

«Классический» протокол выделения ДНК фенол-хлороформным методом [11]:

1. Добавить к ткани 400 мкл лизирующего буфера (вариаций существует довольно много, классический вариант – буфер с SDS) и протеиназу К (количество зависит от концентрации фермента и временных возможностей выделяющего – чем больше добавить, тем быстрее лизируется). 
2. Оставить в термостате минимум на 1 час при 56˚С (Идеально в термошейкере, максимум можно лизировать ночь). 
3. Добавить равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), тщательно перемешать. 
*Иногда, если ткань очень богата белком добавляют на этой стадии чистый фенол.
4. Центрифугировать 10 минут на максимальной скорости. 
5. Аккуратно отобрать носиком супернатант в новую пробирку. Задевать границу фаз ни в коем случае нельзя! 
6. Добавить равный объем хлороформа, тщательно перемешать и повторить процедуру 4-5. 
7. К супернатанту добавить изопропанол в количестве 80% от объема образца и насыщенный раствор NaCl в количестве 1/9 от объема образца. Тщательно перемешать. 
8. Инкубировать при -20˚С в течение 20 минут. 
* Иногда уже на этой стадии можно увидеть ДНК – она выпадает в виде желеообразного осадка, но так бывает далеко не всегда. 
9. Центрифугировать на максимальной скорости 10 минут. 
10. Аккуратно удалить раствор с помощью дозатора, не задевая осадка (осадок – это и есть ДНК). 
11. Добавить 300-500 мкл чистого 70% этанола. Центрифугировать на максимальной скорости.  (Дополнительная промывка ДНК. Добавление 70% этанола удаляет некоторые соли, присутствующие в оставшемся супернатанте и связанные с осадком ДНК).
12. Аккуратно убрать этанол. Остатки этанола высушить, поставив пробирки в термостат на 37˚С. (Важно, чтобы не осталось ни капли этанола). 
13. Разбавить осадок однократным буфером ТЕ (можно разбавить и бидистиллятом, но тогда ДНК не будет долго храниться).   
ДНК, выделенная фенол-хлороформным методом, готова к постановке ПЦР не сразу – нужно подождать несколько часов, а лучше день, для наилучшего растворения осадка.

Преимущества метода: 
• Высокие качество и выход ДНК. Техника дешевая, простая и надежная.

Недостатки метода:
• Проводится только в вытяжном шкафу, пары фенола вредны для здоровья. Требует навыков работы с дозатором. Качество выделенной ДНК напрямую зависит от навыков лаборанта.

Экстракция ДНК на спин-колонке относится к твердофазной экстракции ДНК, поскольку для выделения нуклеиновой кислоты в ней используется твердая фаза, обычно кремнезем (Диоксид кремния – SiO2). Кремнезем использовался в различных экспериментах по экстракции ДНК с 1979 года. В условиях с низким содержанием солей и высокой щелочностью, кремнезем избирательно связывался с отрицательно заряженной ДНК. Метод впервые был опубликован Маккормиком с соавт. в 1989 году [4].

В данном методе отсутствует обширная химическая подготовка, и процесс завершается в несколько этапов. Одним из основных преимуществ спин-колонок является отсутствие опасных химических веществ, таких как фенол и хлороформ. Вместо этого несколько химических растворов и два-три центрифугирования делают весь процесс простым и безопасным.

Принцип экстракции ДНК на спин-колонке:

Биологический образец, содержащий белки, липиды и другие клеточные компоненты, расщепляется с использованием лизирующего раствора и протеиназы К. Лизат наносится на спин-колонку, где он связывается с положительно заряженной поверхностью твердого кремнезема. Промывочный буфер удаляет весь другой мусор, в то время как чистая ДНК элюируется при обработке специальным буфером с высоким pH и солью.

Этапы:

Лизис и адсорбция
Лизис на спин-колонке происходит так же, как традиционный/ручной процесс выделения ДНК. В отдельной пробирке к образцу добавляют раствор Протеиназы К и буфер для лизиса (оба предоставляются производителями наборов) и инкубируют от 15 до 20 минут.
После завершения лизиса, лизат переносят в пробирку спин-колонки, где происходит связывание ДНК с матрицей. При этом остальные клеточные компоненты остаются в растворе.

Отмывка
На следующем этапе выполняется отделение содержимого лизата от связанной ДНК. Буфер для промывки обычно содержит либо этанол, либо изопропанол и избирательно удаляет только остатки клеток, белки и другие клеточные молекулы. Через поры кремнезема и под действием центробежной силы или вакуума лизат пропускают из колонки и собирают в пробирку для сбора. Этап промывки можно повторить, для получения ДНК более высокого качества. Однако, частая промывка вызывает потерю ДНК и снижает ее выход.

Элюция
На последнем этапе связанная ДНК элюируется из колонки. В колонку добавляют буферы для элюирования с высоким pH и солью, которые растворяют ДНК, удаляя связь между фосфатом ДНК (отрицательный заряд) и силикагелем (положительный заряд). Примером буфера для элюции является буферный раствор TE (pH = 9,0).

Преимущества метода:
• Безопасность
• Отсутствие предварительной подготовки
• Быстрота выделения
• Высокая чистота
• Эффективность
• Требуется небольшое количество исходного материала
• Подходит для новичков
• Воспроизводимость результатов

Недостатки метода:
• Потеря материала при промывке
• Сниженный выход ДНК по сравнению с ручными методами
• Меньше вариантов оптимизации
• Более дорогой

Со всеми преимуществами и недостатками технология экстракции ДНК с помощью спин-колонок на сегодняшний день является наиболее распространенной технологией, как в научных исследованиях, так и в диагностике. Несомненно, это своего рода полуавтоматическая, быстрая и почти совершенная техника выделения и очистки любой ДНК.
Наборы для выделения со спин-колонками также используются для выделения ДНК из чувствительных образцов, таких как костный мозг, твердая опухолевая ткань, сперма, амниотическая жидкость, ворсинки хориона, бесклеточная ДНК или опухолевая ДНК.
Для процедур, таких как выделение крови или ДНК растений, хорошим вариантом являются ручные методы. Спин-колонки экономят время и обеспечивают рабочий выход и чистоту.

Магнитные частицы («магнитные шарики» или англ. «magnetic beads») представляют собой набор однородных частиц размером 0,5-10 мкм, изготовленных из магнитных материалов. Такие магнитные материалы обычно представляют собой композиты, содержащие наночастицы магнетита (Fe3O4) [20]. Частицы намагничиваются в присутствии магнитного поля, что придает им парамагнитные свойства.

Для выделения используют магнитные носители с иммобилизованными лигандами, например биополимерами, проявляющими аффинность к нуклеиновой кислоте-мишени [1].

Таким образом, к клеточному лизату добавляются магнитные частицы со связанным лигандом, и в присутствии магнитного поля происходит инкубация частиц и нуклеиновой кислоты. Далее, с помощью магнита, который приближают к пробирке, намагниченные частицы со связанной ДНК «прилипают» к её стенке, и таким образом, можно легко удалить клеточное содержимое, находящееся в пробирке. Затем магнитные шарики промывают от остатков контаминирующих фракций специальным буферным раствором, содержащим этанол (англ. «washing buffer»). Пробирку с ДНК отодвигают от магнита и добавляют буфер для элюции, позволяя ДНК перейти в раствор. Чтобы снова отделить магнитные частицы от растворенной в буфере ДНК, снова приближают магнит, и дозатором отбирают раствор с ДНК.

►ДНК и РНК связываются одними и теми же магнитными шариками. Чтобы удалить РНК из ДНК, РНК разрушают перед стадией выделения ДНК, добавляя РНКазу. И наоборот, РНК можно отделить от ДНК, добавив ДНКазу.

►Для выделения различных типов нуклеиновых кислот, производителями создаются определенные «связующие звенья» между магнитной частицей и мишенью. Например, можно использовать комплементарные последовательности ДНК или РНК, или ДНК-связывающие белки, а также вирусные белки, связывающиеся с вирусными нуклеиновыми кислотами [6]. Олигодезокситимидин, иммобилизованный с магнитными частицами, можно эффективно использовать для быстрого выделения высокоочищенной мРНК из культур эукариотических клеток или препаратов тотальной РНК [3]. Эти процедуры основаны на гибридизации олигонуклеотидной последовательности dT со стабильными полиаденилированными 3’-концами эукариотической мРНК. Другие компании предлагают магнитные частицы с иммобилизованным биотинилированным олигонуклеотидом, стрептавидином, которые можно использовать для выделения мРНК [1].

На основе метода с использованием магнитных частиц производятся автоматические системы выделения нуклеиновых кислот. Магнитные частицы хорошо подходят для:
• подготовка образцов для ПЦР и NGS (секвенирование нового поколения) 
• очистка различных типов биомолекул, включая геномную ДНК, плазмиды, митохондриальную ДНК, РНК и белки
• молекулярная и иммунодиагностика
• магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) и многое другое.

Преимущества метода:
• Быстрый, точный, безопасный, надежный и может работать с большими количествами образцов
• Не требует центрифугирования и обширной химической подготовки
• Может быть автоматизирован. 

Недостатки метода:
• Требуется дополнительная настройка магнитного прибора.

В 1990 году Дойл представил метод CTAB для выделения ДНК растений [2]. Технически, для этого требуется буфер с низкой ионной силой и pH>7 (щелочной pH). CTAB (цетилтриметил бромид аммония) — это химическое вещество, часто используемое для выделения ДНК. Экстракция ДНК на основе CTAB представляет собой метод жидкостной экстракции. 

Для повышения эффективности протоколов также могут комбинироваться другие детергенты, такие как SDS, бета-меркаптоэтанол, PVP и Triton X-100. CTAB и SDS удаляют твердые гликопротеины, а остальные химические вещества удаляют полифенольные соединения.  

Процедура выделения растительной ДНК-СТАB состоит из нескольких стадий: лизис клеток, разрушение РНК, депротеинизация и экстракция ДНК с помощью органических веществ (хлороформ) и последнее осаждение нуклеиновых кислот с помощью этанола или изопропанола (как мы уже знаем, ДНК осаждается из раствора с помощью спирта при наличии высокой концентрации ионов натрия, или лития, или аммония). Для разрушения клеточных стенок, листья растений тщательно растирают в ступке в присутствиии CTAB Буфера или ошлифованным стеклянным пестиком в пробирке типа «Eppendorf». Трис, входящий в состав буфера, обеспечивает необходимый pH раство
ра (ДНК наиболее стабильна при рН от 7.0 до 8.5). Также в состав раствора входит ЭДТА.

CTAB – катионный детергент, который эффективно разрушает клеточные мембраны, и при высокой концентрации NaCl (1М) нуклеиновые кислоты растворяются, а белки и полисахариды осаждаются из раствора. После экстракции хлороформом комплекс СТАB с полисахаридами и белками оказывается в интерфазе и в органической фазе. Для осаждения белков и растворения комплекса ДНК-СТАB в буфер для экстракции добавляют 1,4М NaCl. Для удаления РНК дополнительно в буфер для экстракции, перед использованием, добавляют РНКазу А. 

Для экстракции ДНК из раствора используется смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1). 

Осаждение ДНК проводится равным объемом изопропилового спирта при комнатной температуре. Процедуру осаждения ДНК необходимо проводить быстро, чтобы предотвратить осаждение полисахаридов и пигментов с осадком ДНК. Осадок ДНК тщательно промывают 70% этанолом, чтобы удалить остатки буфера для экстракции, изопропанола и хлороформа.

Протокол экстракции ДНК из листьев древесных растений [10]:

1. 100 мг свежих листьев или проростков растений растереть в пробирке «Eppendorf» объемом 1,5 мл с  500 мкл CTAB-буфера для ДНК экстракции,  добавить 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл), перемешать на вортексе и инкубировать при 55–65°C в течение 30–60 мин. Дополнительно доинкубировать при 37°C в течение 10–15 мин., чтобы РНКаза А разрушила геномную РНК.   
2. В пробирку добавить равный объем (500–600 мкл) смеси хлороформ: изоамиловый спирт (25:1), тщательно перемешать на вортексе (важно максимально отделить ДНК от белков) и центрифугировать при 14000 об/мин. 5 мин. (разделение органической и  водной фаз).
3. Верхнюю водную фракцию перенести в чистую 1,5 мл пробирку, содержащую равный объем (600 мкл) холодного изопропанола (+4°C), и тщательно перемешать на вортексе (спирт осаждает ДНК из раствора при тщательном перемешивании). 
4.  ДНК осадить центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин; надосадочную жидкость осторожно слить.
5. Добавить в пробирку с осадком ДНК 1мл 70% этанола, тщательно перемешать на вортексе, чтобы осадок плавал в спирте. Повторить центрифугирование в течение 5 мин при 14000 об/мин; надосадочную жидкость аккуратно слить (осадок плохо удерживается на дне пробирки после промывки в 70% этаноле). 
6. Осадок ДНК не сушить и сразу растворить в 200–500 мкл 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0 1mM ЭДТА) при 55°С, периодически перемешивая, 10–20 минут. Как правило, осадок ДНК сразу же всплывает на поверхность раствора 1хТЕ и растворяется. ДНК хранить при температуре -20°С (длительное хранение) или при +4°С (при частом использовании). 
7. Концентрацию ДНК определить с помощью спектрофотометра. 
8. Раствор ДНК разбавить в новые микропробирки до концентрации 10 нг/мкл и хранить при 4°С. Раствор ДНК хранить при  -20°С.

Преимущества метода:
• Буфер CTAB эффективно удаляет полисахариды и полифенолы. Дает отличный выход ДНК растений.

Недостатки метода:
• Требуется обширная химическая подготовка. Выделение ДНК CTAB – это трудоемкий и утомительный метод. Данный способ выделения также требует дополнительных методов, таких как гомогенизация тканей и использование жидкого азота.

Выделение нуклеиновых кислот с помощью Протеиназы К является ферментативным методом выделения. «Протеиназа» означает - «фермент, расщепляющий белок», приставка «К» - «Кератин». Кератин является белком волос и самой твердой формой белка. Протеиназа — первый фермент, выделенный из гриба Tritirachium album который обладал способностью расщеплять кератин. Первая Протеиназа К была выделена в 1974 году и является наиболее часто используемой эндопептидазой в экстракции ДНК.

Роль Протеиназы К в экстракции ДНК

Основная часть клетки состоит из белков: белки ядерной мембраны, ферменты, лиганды, рецепторы, шапероны, антитела и другие лиганды, специфичные для рецепторов.  Кроме того, клеточная мембрана и ядерная мембрана состоят из сложного белка, такого как фосфолипид, гликопротеин и сфингомиелин (смесь белков, а также некоторых липидов, углеводов и других молекул).

Протеиназа К расщепляет белковую часть этих молекул. Далее она расщепляет белки шапероны, связанные с ДНК, которые состоят из длинной цепочки аминокислот. 

В зависимости от характера взаимодействия с водой, аминокислоты делятся на гидрофильные (притягивают воду) и гидрофобные (отталкивают воду). Протеиназа К расщепляет, в основном, гидрофобные аминокислоты (как ароматические, так и алифатические). Кофактор, ион кальция, обеспечивает стабильность фермента, однако не может повысить активность реакции.

Наибольшая активность протеиназы К отмечается при температуре 60°С (в диапазоне от 37°С до 70°С) и при рН = 8,0 (что требуется при экстракции ДНК). Протеиназа К дает лучшие результаты в присутствии других химических веществ. Химические вещества, такие как додецилсульфат натрия, ЭДТА, мочевина, CTAB и Nonidet P40, могут использоваться для переваривания белка. В сочетании с этими химическими веществами протеиназа К повышает эффективность результата за счет повышения чистоты ДНК. 

Кроме того, протеиназа К хорошо работает вместе с другими ферментами, такими как трипсин, химотрипсин и РНКаза. Выделение ДНК зависит от того, какие типы тканей используются. Возможно использовать другие комбинации протеиназы К, ферментов и химических веществ [19].

Протокол выделения ДНК из крови с помощью Протеиназы К [16]:

Взять 2 мл образца крови и добавить к образцу от 10 до 20 мкл буфера TE. Хорошо перемешать.
1. Центрифугировать образец при 2500 об/мин в течение 20 минут.
2. Удалить супернатант и добавить от 10 до 15 мкл буфера TE к осадку и осторожно перемешать.
3. Центрифугировать образец при 2500 об/мин в течение 15 минут. Удалить супернатант и добавить 20 мкл раствора Протеиназы К (коммерческого, готового к использованию) и 2 мл Буфера для экстракции ДНК (коммерческий или приготовленный вручную*) в пробирку типа Falcon.
4. Инкубировать образец при температуре от 56 ℃ до 60 ℃ в течение 1–2 часов или до полного растворения осадка.
5. Добавить в пробирку Falcon от 1 до 2 мл охлажденного изопропанола и щепотку NaCl и перевернуть пробирку на некоторое время, чтобы получить осадок.
6. Центрифугировать пробирку при скорости от 8000 до 10000 об/мин, чтобы осадок осел на дне.
7. Удалить супернатант, добавить 1 мл этанола и центрифугировать при 10 000 об/мин в течение 1–2 минут.
8. Удалить этанол, осадок высушить, далее растворить осадок в буфере TE (pH 8,0) 

* Состав буфера для экстракции ДНК варьируется от протокола к протоколу. Для широкого применения в буфер для экстракции ДНК включают Трис, ЭДТА, NaCl, SDS или Triton X 100. [16]. Пример состава буфера: 10мM Tris-HСl (pH = 8,0), 0,5М NaCl, 1мM EDTA.

Преимущества метода:
• Прост в использовании, обеспечивает высокую чистоту и выход НК. Безопасный в использовании, точный и быстрый. Можно использовать для любого образца. Может сочетаться с любым протоколом. Позволяет выделять ДНК из небольших объёмов.

Недостатки метода:
• Единственным ограничением этого метода является сама Протеиназа К. Т.к. это фермент, время хранения и время активности лимитированы.

Чтобы получить достаточное количество генетического материала для реакций ПЦР из следовых количеств биологических образцов, Сингер-Сэм предложил использовать ионообменную смолу Chelex 100 [7]. Chelex 100 представляет собой сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий спаренные ионы иминодиацетата. Он действует путем хелатирования ионов переходных металлов, селективность которых зависит от иминодиуксусной кислоты. Катионообменная способность смолы функциональна при нейтральном или слабокислом pH (> 4,0). При очень низком pH смола начинает действовать как анионообменник. Следовательно, Chelex классифицируется как слабокислотный катионообменник с высоким сродством к ионам двухвалентных металлов.

Первый протокол выделения ДНК с использованием Chelex 100 был разработан Walsh et al. в 1991 г. [9]. Этот метод, нашедший применение в основном в криминалистике, заключается в тепловой денатурации клеток, которые могут быть прикреплены к бумаге или ткани, в растворе, содержащем смолу. Высокие температуры приводят к высвобождению ДНК в раствор, а также способствуют связыванию смолы Chelex с ионами магния. Ионы магния служат кофакторами дезоксирибонуклеаз и способствуют их активации. Поскольку ионы магния становятся недоступными для связывания с дезоксирибонуклеазами, предотвращается деградация ДНК. После того, как этот протокол был установлен, смола Chelex 100 стала предпочтительным методом для протоколов, требующих быстрой экстракции ДНК из следовых количеств биологических образцов.

Одновременное использование анионных смол и Протеиназы К хелатирует ион металла для ДНКазы и переваривает белки клетки. Центрифугирование восстанавливает ДНК. Проще говоря, процесс завершается в три этапа: добавить в образец Chelex 100 и Протеиназу К, прокипятить его, отцентрифугировать и собрать нуклеиновую кислоту.

Протокол выделения ДНК из пятен крови с помощью ионообменной смолы Chelex 100 [12]:

Образец: 3-5 мкл цельной крови или пятно крови диаметром 1-5 мм.
1. В микроцентрифужную пробирку объёмом 1,5 мл внести 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 3-5 мкл жидкой крови или фрагмент носителя с сухой кровью, перемешать.
2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, периодически перемешивая. В случае сухой крови, инкубацию можно увеличить.
3. Центрифугировать в течение 2-3 минут при 10 000 - 15 000 об/мин.
4. Удалить 970-980 мкл супернатанта, оставив в пробирке приблизительно 20-30 мкл. При исследовании пятна, в пробирке с осадком оставляют также предмет-носитель.
5. Добавить 5% взвесь Chelex до конечного объема 200 мкл. Когда отбирают Chelex 100, взвесь должна быть однородной. Для этого, во время отбора, Chelex перемешивают на магнитной мешалке. Необходимо использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
6. Инкубировать при температуре 56⁰С в течение 15-30 минут.
7. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
8. Пробы инкубировать в кипящей водяной бане или в термостате с ячейками при температуре 1000С в течение 8 минут.
9. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
10. Центрифугировать в течение 2-3 минут при 10 000 – 15 000 об/мин.
11. Для постановки ПЦР используют супернатант. ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, поэтому оценить качество и количество выделенной ДНК при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий, нельзя.
12. Остатки супернатанта хранят при температуре 2-8⁰C или при -20⁰C (длительное хранение)
13. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.

Преимущества метода:
• Быстрый, экономичный, безопасный и простой в использовании.

Недостатки метода:
• Хотя выделение геномной ДНК с помощью смолы Chelex 100 является быстрым и недорогим, ДНК, полученная этим методом, имеет низкую концентрацию в растворе и содержит взвешенные примеси. Присутствие дебриса в растворе ДНК может привести к деградации ДНК при длительном хранении и ингибированию полимеразной цепной реакции. Для улучшения качества выделенной ДНК может использоваться оптимизация протоколов [8].

Со времени первой экстракции ДНК, проведенной Фридрихом Мишером в 1869 году, ученые добились выдающегося прогресса в разработке методов экстракции, которые являются более надежными, простыми и быстрыми в выполнении. Более надежные и эффективные новые методы способствовали расширению знаний о геноме человека и сыграли важную роль в появлении различных областей науки, таких как редактирование генов и персонализированная медицина. Однако в настоящее время не существует единой процедуры, применимой ко всем объектам выделения ДНК из-за их ограничений в получении выходов с оптимальной чистотой и удобством использования. Следовательно, для достижения лучших результатов и упрощения работы с ДНК необходимы решения для преодоления ограничений этих методов, т.е. чтобы сделать протокол выделения ДНК более эффективным, необходимо провести его оптимизацию. Но возникает вопрос: если доступны готовые к использованию наборы для выделения ДНК, то для чего необходима оптимизация? Да, действительно, для выделения нуклеиновых кислот из основных биологических материалов, таких как кровь, слюна, бактерии E. coli, уже изобретены готовые к использованию наборы. Но, без понимания основных методов ручного выделения, невозможно понять, как работают различные химические вещества и какова их роль. Также, невозможно понять, как составлять протоколы выделения ДНК, например из сложных объектов, таких как растения, ткани, гнилостные ткани, человеческие останки, пятна крови и др.

Поэтому, компания «ПЦР-МАГ» помогает решать задачи по выделению нуклеиновых кислот из различных биологических образцов, предоставляя как готовые коммерческие наборы, так и компоненты методов выделения.