+
Каталог товаров
+
15 апреля 2023
Полимеразная цепная реакция — высокоточный метод молекулярной биологии, который позволяет обнаружить ДНК и РНК различных организмов. Метод отличается чувствительностью и специфичностью, а также скоростью получения результата. Для проведения реакции необходимо такое лабораторное оборудование, как ламинарный бокс, амплификатор, термошейкер и др., реагенты для постановки реакции, а также расходные материалы, изготавливаемые из пластика.
Расходные материалы из пластика, для обеспечения оптимальной производительности ПЦР, должны быть высокого качества и свободными от загрязняющих веществ и ингибиторов. Для проведения успешной реакции, сотруднику лаборатории необходимо понимать разновидности пластика для классической и количественной ПЦР, а также варианты его применения.
В данном обзоре мы дадим объяснение основным используемым типам пластиковых расходных материалов для ПЦР.
Пластмассы для ПЦР/количественной ПЦР чаще всего изготавливаются из полипропилена, поскольку он инертен и способен выдерживать быстрые изменения температур во время термоциклирования. Инертные свойства полипропилена сводят к минимуму поглощение компонентов реакции, помогая обеспечить оптимальные результаты. Для дальнейшего обеспечения однородности чистоты и биосовместимости от партии к партии, в производстве используют высококачественный первичный полипропилен, подобный тому, который используется для изготовления пластиковых изделий медицинского назначения.
При изготовлении некоторых планшетов для ПЦР/кПЦР, с применением в роботизированных системах, используется более прочный поликарбонат (Рисунок 1).
Пробирки и планшеты для ПЦР часто доступны в различных цветах для облегчения визуальной организации и идентификации образцов, особенно для высокопроизводительных экспериментов. Хотя цвет пластика не влияет на амплификацию ДНК, при настройке реакций для ПЦР в реальном времени, может быть рекомендован белый и/или матовый пластик, а не прозрачный, чтобы обеспечить чувствительное и точное обнаружение флуоресценции [3]. Пользователи должны следовать рекомендациям производителя амплификатора кПЦР в отношении цвета.
Белый пластик повышает чувствительность данных кПЦР, предотвращая преломление флуоресценции в пробирке и за её пределами [3]. При минимальном преломлении большее количество сигнала отражается обратно к детектору, увеличивая отношение сигнал/шум [3]. Кроме того, белая стенка минимизирует различия между техническими повторностями, предотвращая передачу сигналов флуоресценции в блок термоциклера, где они могут поглощаться или непоследовательно отражаться. В редких случаях, когда детектор флуоресценции может быть перенасыщен из-за повышенного отражения сигнала от белой лунки, лучшей альтернативой могут быть матовые лунки.
Для герметизации пробирок и планшетов для кПЦР, следует использовать сверхчистые колпачки, чтобы повысить чувствительность и уменьшить вариабельность, поскольку такие закрывающие элементы специально разработаны для обеспечения прохождения сигналов флуоресценции без помех.
Чтобы избежать загрязнений, которые могут помешать амплификации ДНК, пластиковые расходные материалы для ПЦР/кПЦР не должны содержать нуклеаз и ДНК. Хотя методы стерилизации, такие как автоклавирование и облучение, уничтожают бактерии и ДНКазы, сами по себе эти подходы не могут удалить пыль и остатки ДНК. Оставшиеся частицы пыли могут ингибировать ПЦР, а фрагментированная ДНК все еще может действовать как матрица для неспецифической амплификации.
Следовательно, производство пластмасс, от формования до окончательной упаковки, должно осуществляться на установках, которые ограничивают количество микрочастиц в окружающей среде. Например, в чистых помещениях класса 100 000 допускается наличие не более 100 000 частиц диаметром ≥ 0,5 мкм в 0,028 м3 воздуха. Такие типы установок для производства соответствуют строгим руководящим принципам, установленным Международной организацией по стандартизации (например, ISO 9001), для предотвращения пыли и биологического загрязнения.
Для обеспечения качества, пластиковые расходные материалы для ПЦР/кПЦР могут быть визуально и/или физически проверены производителем на предмет их целостности. Для оценки испарения и герметизации, могут быть выполнены физические тесты на наличие утечек. Для оценки загрязнения нуклеазами и ДНК человека пластмассы могут подвергаться кПЦР-амплификации определенных ДНК-мишеней. Производитель может предоставлять сертификат анализа на ПЦР/кПЦР-пластик, который прошел такие строгие испытания.
Пластиковые материалы для ПЦР/кПЦР бывают разных размеров и форм. Понимание их особенностей и соответствующей терминологии может помочь исследователю достичь оптимальных результатов ПЦР и кПЦР.
Реакционные объемы изделий
Объем ПЦР/кПЦР-изделий из пластика определяет размер (объем) ПЦР/кПЦР реакции. Чрезмерное наполнение реакционной емкости может привести к неэффективной теплопередаче, разливам и перекрестному загрязнению. С другой стороны, недостаточное наполнение может привести к потере образца из-за испарения. Термоблок также определяет размер используемых пластмасс и их оптимальную посадку для обеспечения целостности и эффективной теплопередачи. Наиболее распространенные размеры емкостей для ПЦР/кПЦР, следующие:
Профиль
Профиль емкости для ПЦР/кПЦР соответствует ее высоте, поэтому “низкий профиль” означает, что высота пробирки уменьшена (Рисунок 2). Укороченная конструкция низкопрофильных пластмасс сводит к минимуму воздушное пространство над реакцией, уменьшая эффект испарения и повышая теплопроводность. Поэтому, при возможности, рекомендуется использовать низкопрофильный вариант. Низкопрофильные пластмассы обычно требуются для быстродействующих термоблоков, и поэтому их иногда называют “быстрыми” пробирками или планшетами.
Толщина стенки
Пробирки и планшеты для ПЦР / КПЦР с однородными тонкими стенками обеспечивают максимальную равномерную передачу тепла к реакционным образцам и от них. Пластик с ультратонкими стенками, который примерно на 50% тоньше стандартной версии, дополнительно снижает тепловой барьер, что приводит к более быстрым и точным реакциям.
Прозрачность
Колпачки и крышки пластмасс для кПЦР должны обладать высокой оптической прозрачностью, чтобы максимизировать прохождение сигналов флуоресценции и минимизировать искажения. Для улучшения данных кПЦР рекомендуется использовать емкости белого цвета, как описано выше.
Пробирки являются идеальным выбором для экспериментов по ПЦР/кПЦР с низкой и средней производительностью. Индивидуальные пробирки и полоски пробирок (стрипы) - два наиболее распространенных доступных формата (Рисунок 3).
Одиночные пробирки обеспечивают гибкость настройки точного количества проводимых реакций. Кроме того, объем 0,5 мл доступен в основном, в отдельных пробирках, когда требуется более масштабная реакция.
Стрипы пробирок обычно выпускаются в виде полосок по 8 или 12 штук с отдельными или прикрепленными крышками. Разработанные для работы как с одноканальными, так и с многоканальными дозаторами, полоски пробирок подходят для экспериментов с низкой и средней производительностью. Пробирки с прикрепленными крышками позволяют их открывать и закрывать независимо друг от друга, чтобы предотвратить загрязнение образца.
В некоторых термоциклерах, которые для эффективной ПЦР оказывают сильное давление на крышку, может потребоваться специальный лоток/фиксатор для предотвращения смятия индивидуальных пробирок и стрипов.
Планшеты для ПЦР/кПЦР обычно выпускаются в форматах с 96 лунками и 384 лунками и, в меньшей степени, с 24 лунками и 48 лунками (см. также сегментацию планшетов). Используемый термоциклер и характер выполняемых приложений будут определять, подходят ли следующие характеристики планшетов для ПЦР/кПЦР.
Юбка
«Юбка» планшета для ПЦР/кПЦР представляет собой периферийную панель вокруг планшета (Рисунок 4). Юбка обеспечивает стабильность планшета во время пипетирования в реакционной установке и механическую прочность для лучшего взаимодействия с роботизированными системами. Планшеты для ПЦР/кПЦР могут быть классифицированы как планшеты «без юбки» (бортиков), «с полуюбкой» (полубортами) и «с юбкой» (полным бортиком).
На планшете без контуров отсутствует окружающая панель (Рисунок 4а). Этот формат подходит для блоков большинства термоциклеров и приборов для ПЦР в режиме реального времени, но он не подходит для роботизированных станций.
Планшет с «полуюбкой» имеет короткую панель по краю (Рисунок 4б), обеспечивающую достаточную поддержку во время пипетирования и механическую прочность при использовании с роботизированными приборами.
Планшет для ПЦР/кПЦР с полным бортиком имеет панель во всю высоту (Рисунок 4в). Этот формат планшетов разработан для установки в термоциклер с приподнятым блоком (что облегчает роботизированное управление). Полные бортики также повышают механическую прочность, что делает данный вид планшетов превосходным для использования с роботизированными платформами в автоматизированном рабочем процессе.
► Для обеспечения совместимости с различными высокопроизводительными системами с роботизированной обработкой жидкостей, планшеты для ПЦР/кПЦР должны соответствовать стандартным размерам, установленным Американским национальным институтом стандартов (ANSI) и Обществом биомолекулярных наук (SBS, в настоящее время входящее в Ассоциацию лабораторной автоматизации и скрининга (SLAS)). Пластины формата ANSI/SBS сохраняют стандартные размеры, высоту, расположение отверстий и т.д., тем самым оптимизируя процесс автоматизации.
Верх планшета
Верх планшета может быть с плоскими и приподнятыми краями (Рисунок 5).
Конструкция с плоскими краями обеспечивает универсальную посадку в большинство термоциклеров и облегчает герметизацию.
Конструкция с приподнятым краем необходима для оптимальной установки и производительности, для некоторых термоциклеров, помогая сбалансировать давление на крышку без использования адаптеров.
Срез края планшета
Срез планшета представляет собой измененный угол планшета, который определяется используемым амплификатором, для оптимальной подгонки планшета. Срез может находиться в положении H1, H12 или A12 96-луночного планшета или в положении A24 384-луночного планшета (Рисунок 6).
Сегментация
Некоторые 96-луночные планшеты для ПЦР/кПЦР сконструированы с возможностью сегментации. Такая конструкция позволяет легко разбивать 96-луночную пластину на пластины меньшего размера, когда вся пластина не используется, что сокращает расходные материалы и стоимость. Наиболее распространены пластины с сегментами на 24 лунки, но для удобства также доступны сегменты на 32 лунки и 8 лунок (Рисунок 7).
Наиболее распространенные типы закрывающих материалов для планшетов и пробирок для ПЦР— это крышки в виде стрипов, клейкие пленки и силиконовые маты. Стрипы-крышки могут использоваться для герметизации как стрипов пробирок для ПЦР/кПЦР, так и планшетов, но пленки предназначены для герметизации только планшетов для ПЦР/кПЦР. Для получения надежных данных кПЦР, крышки и пленки, предназначенные для использования в кПЦР, должны обладать высокой оптической прозрачностью при одинаковой толщине. Силиконовые маты являются альтернативой пленкам и крышкам: их можно использовать многократно (Таблица 1).
| Тип закрывающего материала | Характеристики |
|
Крышки |
♦ Могут использоваться как с пробирками, так и с планшетами ♦ Должны соответствовать диаметру пробирки ♦ Герметично закрываются с возможностью многократного открывания и закрывания |
|
Плёнки |
♦ Подходят для большинства 96-луночных и 384-луночных планшетов ♦ Могут быть сегментированы для работы с планшетами меньших размеров (например, 24-луночных) ♦Существуют различные варианты герметизации (термическая, прокалываемая, повторно закрываемая) |
|
Силиконовые маты |
♦ Многоразовые ♦ Автоклавируемые ♦ Не подходят для кПЦР ♦ Могут быть сегментированы для работы с планшетами меньших размеров. |
Важно!
Колпачки и пленки должны надежно закрывать пробирки и планшеты, чтобы предотвратить испарение образца во время термоциклирования. Для облегчения надлежащей герметизации существуют такие инструменты, как аппликаторы и инструменты для герметизации.
Полоски крышек (стрипы) являются наиболее распространенной формой герметизации стрипов пробирок и 96-луночных планшетов для ПЦР/кПЦР (Рисунок 8). В дополнение к посадке, прозрачность и форма — это две основные характеристики, которые следует учитывать при выборе крышек.
Хотя прозрачность колпачков не влияет на амплификацию ДНК, сверхчистые или оптически прозрачные колпачки важны для сбора данных в экспериментах кПЦР. Верхняя часть колпачка может быть плоской или выпуклой. Выбор между ними зависит от конструкции крышки используемого амплификатора.
Крышка может иметь слегка вогнутую внутреннюю поверхность для предотвращения деформации пробирок, куполообразные колпачки обеспечивают лучшую посадку при анализе ПЦР, одновременно действуя как амортизатор давления, для поддержания целостности пробирок.
Плоские колпачки образуют поверхность для маркировки образцов (при ПЦР), и предназначены для амплификаторов с плоскими крышками.
Оптические колпачки для кПЦР-анализов часто бывают плоскими, чтобы обеспечить неискаженное прохождение сигналов флуоресценции.
Герметизирующие пленки для ПЦР-планшетов могут быть изготовлены из прозрачного пластика или алюминиевой фольги, каждая из которых обладает уникальными преимуществами (Рисунок 9).
Клейкие прозрачные пленки могут иметь неклеющуюся поверхность, которая герметизирует лунки только после того, как на них было оказано достаточное давление, что позволяет запечатывать планшеты и при необходимости оставлять отверстия лунок чистыми для максимального пропускания флуоресценции. Пленки для кПЦР должны обладать высокой оптической прозрачностью для минимального воздействия на сигнал от образца. Для чувствительных приложений, таких как кПЦР для идентификации человека, запечатывающие пленки должны быть обработаны производителем окисью этилена (соответствует стандарту ISO 18385) для устранения возможных следов ДНК, которые могут привести к ложноположительной амплификации.
Алюминиевые пленки не подходят для кПЦР, но они идеально подходят для светочувствительных образцов, а также поддаются прокалыванию при переносе образцов в ПЦР-планшет. Алюминиевые пленки пригодны как для классической ПЦР, так и для длительного хранения.
Для покрытия ПЦР-планшетов применяются, также, силиконовые маты. Они представляют собой многоразовые, гибкие, силиконовые, уплотнительные коврики. Маты для ПЦР состоят из нереактивной резины, способной выдерживать многократное автоклавирование, экстремальные температуры и действие агрессивных химические веществ. Силиконовые маты незаменимы в случае необходимости длительного хранения образцов при низких температурах. Маты для ПЦР планшетов, служат альтернативой ПЦР пленок и крышек, что позволяет использовать их многократно после дезинфекции. Силиконовые покрытия можно также обрезать по размеру для использования с 24-, 32- или 48-луночными планшетами.
Силиконовые маты не подходят для приложений ПЦР в реальном времени (кПЦР).
Расходные материалы из пластика для проведения ПЦР-реакции играют важную роль в успехе ПЦР, особенно для рабочих процессов со средней и высокой производительностью. Понимание основ применения пластика для ПЦР/кПЦР помогает достигать оптимальных результатов при проведении исследований в лабораториях с различной пропускной способностью.
