15 июля 2023
ДНК может быть извлечена из любой ткани организма, содержащей клетки с ядрами. ДНК является нашим генетическим материалом и несет информацию о нашем здоровье и различных заболеваниях. Таким образом, анализ ДНК раскрывает много информации, связанной со здоровьем.
Адаптация методов тестирования ДНК, таких как ПЦР, секвенирование ДНК и анализ на микрочипах, в медицинских и клинических учреждениях выводит молекулярное тестирование на новый уровень. В то время как другие образцы тела часто тестируются для определенных целей, кровь является наиболее распространенным типом образца.
Кровь легкодоступна и поэтому является легкой мишенью для рутинной экстракции ДНК, особенно в диагностической отрасли. Существует множество наборов и протоколов для выделения геномной ДНК из крови.
Ни один из протоколов не является простым, поскольку вся схема выделения геномной ДНК является чувствительным и утомительным процессом. Таким образом, распространенными проблемами здесь являются получение ДНК хорошего качества, количества и целостности из различных образцов крови, таких как цельная кровь, высохшая капля крови, а также свернувшаяся и замороженная кровь.
Кровь представляет собой жидкую соединительную ткань, состоящую из твердых и жидких компонентов, где жидкость в основном представляет собой плазму, состоящую из воды, белков и солей; эритроциты, лейкоциты и тромбоциты являются твердыми составляющими крови.
Кровь обеспечивает кислородом различные органы и ткани тела с помощью эритроцитов, однако только лейкоциты имеют ядра, а именно ДНК. В красных кровяных тельцах отсутствуют ядра и ДНК, поэтому основной мишенью для выделения ДНК являются лейкоциты.
Безъядерные тромбоциты лишены геномной ДНК и, следовательно, также непригодны для выделения ДНК.
Преимущества использования крови для экстракции ДНК:
Белые кровяные клетки лизируются вслед за красными кровяными тельцами на самых первых этапах, с использованием детергентов, солей и химических веществ. Высвобожденную ДНК выделяют, осаждают, очищают и растворяют в буфере TE.
Есть два способа выполнения лизиса:
При двухэтапном лизисе, лизис эритроцитов и лейкоцитов происходит отдельно. Во-первых, эритроциты без ядра лизируются во время экстракции и удаляются с использованием детергентов, таких как SDS или Triton X-100.
На следующем этапе буфер для лизиса лизирует лейкоциты и высвобождает ДНК. После этого выполняются обычные этапы выделения ДНК, такие как очистка, осаждение, промывка и элюирование.
В методе одностадийного лизиса, лизис эритроцитов и лейкоцитов выполняется в одной реакции с использованием химических веществ и детергентов. Остальные этапы после этого останутся прежними. Двухэтапный лизис является более эффективным, так как ранний и раздельный лизис эритроцитов не будет мешать последующим этапам.
Сбор образца крови является важнейшим этапом для экстракции ДНК. В пробирку с ЭДТА из вены руки забирают от 2 до 5 мл крови (в асептических условиях). Кроме того, образец асептически переносят в пробирку с ЭДТА, хранят или транспортируют при температуре +4°C.
Эритроциты — это безъядерные клетки крови, которые переносят кислород. Для эффективного выделения геномной ДНК эритроциты сначала должны быть лизированы и удалены. Образец крови обрабатывают буфером для лизиса эритроцитов. Буфер должен содержать ЭДТА, бикарбонат натрия, хлорид аммония и другие компоненты.
Лизированные эритроциты удаляются центрифугированием. Белковая часть эритроцитов препятствует реакции ПЦР и, следовательно, является важным условием при экстракции.
Лейкоциты с ядрами обрабатываются лизирующим буфером, который удаляет клеточную мембрану и ядерную оболочку и в результате высвобождает нуклеиновую кислоту. Буфер для экстракции должен содержать детергенты и химикаты, которые удаляют липопротеины, компоненты клеточных мембран и белки.
Кроме того, желательно добавлять протеиназу К и РНКазу, чтобы сделать лизис лейкоцитов эффективным.
Теперь чистую ДНК выделяют центрифугированием и осаждают с использованием охлажденного спирта и 1/10 объема соли. Очистка выполняется путем промывания осадка ДНК спиртом.
Теперь гранулы ДНК высушиваются на воздухе и повторно растворяются с использованием ТЕ-буфера или бидистиллированной воды.
Чтобы использовать ДНК в дальнейшем, мы должны выполнить качественный и количественный анализ ДНК. Спектроскопия исследует чистоту и выход ДНК, в то время как с помощью флуорометрического анализа и гель-электрофореза можно оценить только чистоту и общее качество соответственно.
Соотношение чистой ДНК (260/280) должно быть около 1,80. О том как измерить концентрацию ДНК, мы описали в предыдущей статье.
ДНК следует хранить при +4°C или -80°C для кратковременного и длительного хранения, соответственно.
Итак, мы описали наиболее обычную схему экстракции ДНК из крови. Основные этапы останутся теми же, но химический состав может варьироваться от протокола к протоколу. Теперь рассмотрим, как можно выделить ДНК из различных типов образцов крови (цельной крови, засохшего пятна, свернувшейся крови и замороженной крови).
Цельная кровь берется непосредственно у пациента и является наиболее распространенной тканью для выделения ДНК. Обычный протокол фенол: хлороформ и изоамиловый спирт является здесь наиболее эффективным [1].
1) Добавить от 200 до 300 мкл крови в микроцентрифужную пробирку.
2) Добавить равный объем буфера для лизиса клеток и хорошо перемешать. Перемешивание можно осуществить путем многократного переворачивания пробирки.
3) Далее необходимо следовать либо одноэтапному, либо двухэтапному лизису
Имейте в виду, что, если вы выполняете двухэтапный лизис с использованием двух разных композиций для лизиса клеток, на первом этапе возьмите осадок после лизирующей обработки, а на втором этапе соберите супернатант после обработки вторым буфером для лизиса.
4) Центрифугировать образец на низкой скорости не менее 20 минут. Центрифугирование высвободит нуклеиновую кислоту в супернатант, а клеточный дебрис останется на дне.
5) Добавить еще один лизирующий буфер и/или обработать фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. Этот шаг поможет получить чистую и высокопродуктивную ДНК. При центрифугировании получается раствор ДНК, в верхней части которого ее собирают и добавляют равный объем спирта и 1/10 объема соли. На этом этапе ДНК приобретает видимую форму. Для повышения выхода можно поместить смесь при температуре -20°C на 20 минут, охлаждение улучшает осаждение.
6) Собрать осадок и промыть спиртом дважды (1 мл спирта).
7) На заключительном этапе растворить ДНК в 200-400 мкл ТЕ-буфера.
Протокол PCI прост в использовании и обеспечивает получение ДНК высокой чистоты и с высоким выходом из цельной крови.
Точечный забор высушенной крови используется для неонатального тестирования, фармакокинетического и токсикогеномного анализа. У пациента берут только небольшую каплю крови, обычно из пальца, и оставляют высыхать на бумаге.
В отличие от обычного метода забора крови, данный метод менее болезненный и, следовательно, используется во время неонатального скрининга. Пятну дают высохнуть на воздухе и отправляют на тестирование.
Такой тип взятия образцов безопасен (для специалиста), прост в транспортировке и не требует каких-либо условий. Он не имеет особых условий хранения и транспортировки и, следовательно, используется в программах скрининга из отдаленных мест.
Забор пробы включает укол пятки или пальца стерильной иглой с последующим выделением крови на фильтровальную бумагу. Образцу дают высохнуть на воздухе, хранят и транспортируют в стерильном полиэтиленовом пакете.
1) Далее, бумага с пятнами высушенной крови, разрезается на мелкие кусочки и переносится в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
2) В пробирку добавляют 500 мкл лизирующего буфера и некоторое время оставляют для реакции с DBS («dried blood spot»).
3) После этого в смесь добавляют 10 мкл раствора протеиназы К и оставляют для реакции при комнатной температуре на несколько часов или в соответствии с рекомендациями производителя.
Или
Образец инкубируют в течение 25 минут при 60°C или 95°C в течение 15 минут. Это увеличит выход.
4) После этого необходимо следовать обычному протоколу экстракции ДНК.
а) Центрифугировать образец при 2000 об. /мин. в течение 20 минут.
б) Собрать надосадочную жидкость и удалить осадок, содержащий кусочки фильтровальной бумаги.
в) Осадить ДНК, используя комбинацию спирта и соли, и выполнить промывку.
г) Растворить ДНК в ТЕ-буфере.
Мы часто используем кровь для экстракции ДНК, собранную на основе ЭДТА, однако можно задаться вопросом, что, если у нас свернувшаяся кровь? Или тромб? Можем ли мы извлечь ДНК из свернувшейся крови? Ответ - да.
Два наиболее подходящих протокола для извлечения ДНК из свернувшейся крови используют фенол-хлороформный метод и метод протеиназы К. Покажем выделение ДНК на примере метода с добавлением протеиназы К.
1) Удалить сывороточную часть крови и взять сгусток.
2) Добавить буфер для лизиса эритроцитарных клеток (500 мкл) и хорошо перемешать. Центрифугировать образец и удалить верхнюю фазу.
3) Промыть сгусток свежим буфером и добавить буфер для лизиса лейкоцитов (500 мкл) и протеиназу К (10 мкл). Инкубировать образец при 60°C в течение 30 минут и дать ему остыть при комнатной температуре.
4) Центрифугировать образец и собрать верхнюю водную фазу.
5) Осадить водный раствор спиртом и 1/10 ацетатом натрия.
6) Дважды промыть осадок спиртом и высушить на воздухе.
7) Добавить 300 мкл ТЕ-буфера и растворить осадок ДНК.
Замороженная кровь также используется для выделения ДНК, и это тоже эффективно. Здесь также используется тот же протокол, который используется для выделения ДНК из цельной и высушенной крови. Первым этапом предварительной обработки является сбор образца крови и размораживание его при комнатной температуре.
Размораживть кровь, пока она не станет жидкой. Также возможно инкубировать образец при температуре 60°C. И выполнить выделение. Для критических экспериментов и диагностики лучше использовать набор "spin-column".
Для эффективного повышения чистоты и выхода добавить лизирующий буфер и протеиназу К в замороженную кровь и разморозить ее. Это сделает нуклеазу неактивной.